علم هیستولوژی یا بافت شناسی امروزه در علوم مختلف به خصوص بیولوژی و پزشکی توسعه یافته و هر روزه به پیشرفت آن افزوده می شود. دستگاه میکروتوم به عنوان کاربردی ترین دستگاه در آزمایشگاه های هیستوپاتولوژی جهت برش بافت های با ضخامت در حد میکرون استفاده می شود. به طور کلی این دستگاه برای تهیه برش های بافتی بسیار نازک از بلوک های پارافینی استفاده می شود. دستگاه میکروتوم از دو قسمت تشکیل شده است:
- قسمتی که بر روی آن بلوک تهیه شده را ثابت می کنند.
قسمتی که بر روی آن بلوک ثابت است، مرتبط با یک دسته (چرخ) میکرومتری است که درهر گردش دسته میکروتوم، به اندازه چند میکرون به جلو یا عقب میرود. میکروتوم انواع مختلفی دارد ولی بهترین نوع آن به صورتی است که بر روی چرخ میکروتوم ثابت و در نتیجه مرتب در مقابل تیغ در یک جهت حرکت می کند و بدین ترتیب برش ها تشکیل نوارهای باریکی را می دهند. ميكروتوم كه از كلمه يوناني mikros به معناي كوچك و temnein به معناي بريدن گرفته شده است، ابزاري است كه براي بريدن اساليس هاي بسيار نازك از يك ماده استفاده ميشود. ميكروتوم همچنين براي آماده سازي section هاي باريك از موادي نظير استخوان، دندان و روش جايگزيني براي electropolishing يك فرايند الكتروشيميائي كه مواد را از يك قطعه فلزي حذف كرده و براي پرداخت كردن، اثرناپذير كردن و پليسه گيري كردن قسمتهاي فلزي استفاده ميشود و فرز يون به كار ميرود.
ميكروتوم ها براي آماده سازي نمونه ها براي مشاهده در زير تشعشع الكتروني يا نوري در ميكروسكوپ استفاده ميشود. اسلايس هاي بسيار باريك نمونه را كه اين دستگاه توليد ميكند، section مينامند. sectionهاي ميكروتوم را ميتوان بسيار باريك برش داد؛ به عنوان مثال ميتوان يك تار مو را از عرض آن با ضخامت بين 50mn و 100mn تقسيم كرد. بسته به نوع نمونه و نيز ميزان ضـخـامت مطلوب براي برش نمونه ها، در ميكروتوم ها از تيغه هاي استيل، شيشه يا الماس استفاده ميشود. تيغه هاي استيل براي آماده سازي section هايي از بافتهاي گياهي يا حيواني براي هيستولوژي ميكروسكوپ نوري استفاده ميشود. چاقوهاي شـيـشـه اي بـراي بـريـدن section هـايـي بـراي مـيـكـروسـكـوپ نـوري و نـيز براي بريدن sectionهاي بسيار باريك براي ميكروسكوپ الكتروني استفاده ميشود.
چاقوهاي الماس از درجه صنعتي براي بريدن مواد سخت مانند استخوان، دندان و غيره براي هم ميكروسكوپ الكتروني و هم ميكروسكوپ نوري استفاده ميشود. چاقوهاي الماس با كيفيتGem ،براي بريدن section هاي باريك براي ميكروسكوپ الكتروني استفاده ميشود. مـيـكــروتــوم هــاي چــرخـشــي يــا هـيـسـتـوتـوم هـا نـمـونـه هـاي بـافـت را بـراي تـحـلـيـل ميكروسكوپي در آزمايشگاه هيستولوژي برش ميدهند. اين دستگاهها با يك چاقوي شيشـه اي، استيـل يـا tipped-sarbide-tungsten بـه صـورت خـاص طـراحـي شده اند تا sectionهاي باريك از بافتي كه در يك محيط خاص )به عنوان مثال پارافين، پالستيك و …( جاسازي شده است تهيه كنند. ميكروتوم هاي چرخشي و ديگر انواع ميكروتوم ها شامل برودتي، اولترا، لغزشي (sliding) و … بر اساس چيدمانهاي چاقو و حركت نمونه، طبيعت برش دادن و آماده سازي بافت تقسيم بندي ميشود. ميكروتوم هاي چرخشي براي برش دادن رايج و با حجم بالا مرسوم است و اغلب براي برش دادن بخشهاي پارافين استفاده ميشود.
بر خالف ميكروتوم هاي لغزشي، ميكروتوم هاي چرخشي براي برش دادن section هاي جاسازي شده در celloidin يا بلوكهاي بزرگ نمونه توصيه نميشود (celloidin محيطي است كه با اعمال تركيبي از اسيد سولفوريك و اسيد نيتريك به اكتان ايجاد ميشود و براي جاسازي بافتي كه براي ميكروسكوپي الكتروني برش داده ميشود استفاده ميشود). ميكروتوم هاي چرخشي ميتوانند بلوكهاي بافت را در بازه اي از تنظيمات برش دهند؛ اين بازه وابسته به ميكروتوم است. برشهاي معمول پارافين در 4 تا 6 ميكرومتر انجام ميشود، با اين حال بسياري از دستگاه ها ميتوانند براي رزولوشن بهتر، برش كـمـتـــر از دو مـيـكـــرومـتـــر را نـيـــز انـجـــام دهـنــد. اولتـراميكـروتوم ها كه پايداري و صحت خيلي بيشتري دارند، ميتوانند sectionهاي جاسازي شده در پالستيك با ضخامت 5.0 يا 2.0 ميكرومتر ايجاد كنند.
مرسومترين كاربردهاي ميكروتوم عبارتند از:
تكنيك قديمي هيستولوژي: بافتها از طريق جايگزين كردن آب با پارافين سخت ميشوند. سپس با استفاده از ميكروتوم، بافت با ضخامتهاي از 2mu تا 50mu بريده ميشود. بعد از برش ميتوان بافت را روي يك اساليد ميكروسكوپ قرار داد، (بعد از حذف پارافين، با رنگ هاي آبي مناسب، رنگ شود و با استفاده از يك ميكروسكوپ نوري بررسي شود).
تكنيك Cryosectioning:
بافتهاي غني از آب با منجمدكردن سخت ميشود و در حالت يخ زده، با استفاده از يك ميكروتوم انجماد يا ميكروتوم cryostat بريده ميشود. sectionها رنگ آميزي شده و با ميكروسكوپ نوري بررسي ميشود. اين تكنيك، بسيار سريع تر از هيستولوژي سنتي است )5 دقيقه در مقايسه با 16 ساعت( و همراه با فــرايـنــدهــاي پــزشـكــي، بــراي رسـيــدن بــه يــك تـشـخـيــص ســريــع اسـتـفــاده مــيشــود. Cryosectionهـا ميتوانند همچنين در immunohistochemistry استفاده شود؛ چرا كه منجمدكردن بافت سريع تر از ثابت كننده، تخريب بافت را متوقف ميكند و تركيبات شيميايي آن را نيز، كمتر تغيير ميدهد.
تكنيك ميكروسكوپ الكتروني
تـكـنيـك ميكـروتـومـي گيـاه شنـاسـي
میکروتوم ها بر اساس مکانیزیم های موجود به پنج گروه زیر تقسیم می شوند:
نوع چرخشی (type Rotary) نوع سورتمه ای (type Sledge) نوع لغزشی (type Sliding) نوع مواج (type Rocking) نوع انجمادی (type Freezing)
نوع سورتمه ای:
در میکروتوم سورتمه ای نمونه روی یک نگهدارنده قرار گرفته می شود، این نگهدارنده روی یک ریل حرکتمی کند و بلوک پارافینی را در مقابل تیغه قرار می دهند. زاویه بین نمونه و تیغه میزان فشار مورد نیاز برای برش را تعیین می کند، ضخامت برش ها بین 1تا 60 میکرومتر است. در میکروتوم سورتمه ای نمونه روی یک نگهدارنده قرار گرفته می شود، این نگهدارنده روی یک ریل حرکت می کند و بلوک پارافینی را در مقابل تیغه قرار می دهند. زاویه بین نمونه و تیغه میزان فشار مورد نیاز برای برش را تعیین می کند، ضخامت برش ها بین 1تا 60 میکرومتر است.
میکروتوم چرخشی:
این ابزار یک دستگاه متداول میکروتومی است که این دستگاه طبق یک عمل چرخشی عمل می کند چنان که برش در حقیقت قسمتی از حرکت چرخشی است.
میکروتوم اره ای:
از این نوع به ویژه برای مواد سخت نظیر دندان و استخوان هااست. این نوع میکروتوم دارای یک ارهی چرخشی تو رفته است که ازمیان نمونه عبوروآن را برش می زند.
روش بافت شناسی سنتی:
بافت ها توسط جایگزین کردن آب با پارافین سخت شده و به وسیله میکروتوم به ضخامت های متفاوتی از 2تا25 میکرومتر بریده می شود. درنتیجه بافت می تواند روی یک اسالید میکروسکوپ قرار بگیرد و بعد از انتقال از پارافین برای آزمایش با میکروسکوپ نوری آماده می شود.
برش انجمادی (Cryosection):
در این حالت بافت های غنی از آب به وسیله یخ زدن و برش در حالت یخ زده با میکروتوم انجمادی )freezing microtome )یا میکروتوم سرماسنج (cryostat-microtome(بسیار سخت می شوند. سپس برش ها با یک میکروسکوپ نوری آزمایش می شود.
میکروتومی گیاه شناسی (microtomy Botanical):
مواد سخت مانند چوب، استخوان و چرم به یک غلتک میکروتوم (microtome asledye )نیاز دارد. این میکروتوم ها تیغه های سنگین تری دارند و نمی توانند به نازکی یک میکروتوم عادی برش بزنند. یکی از جدید ترین میکروتوم ها، میکروتوم لیزری است که به جای یک چاقوی مکانیکی، از برش به وسیله لیزر استفاده می کند. این روش بدون تماس (free-contact ) است و نیازی به تکنیک های آماده سازی نمونه ندارد. میکروتوم لیزری توانایی برش اکثر بافت ها در جایگاه اصلی خود بافت را دارا است. بسته به مواد پردازش شده، ضخامت های برش از 10 تا 100 میکرومتر است.
